복합체 시료를 trypsin digestion 하고, 생성되는 tryptic peptide mixture 를 단일 LC-MS/MS 분석을 통해서 복합체 안에 있는 단백질을 동정하게 됩니다.

protein level 과 peptide level 에서 1차 분리를 진행합니다. Peptide level은 복합체 시료를 trypsin digestion 하고, 생성되는 tryptic peptide mixture 를 strong cation exchange (SCX), high-pH reversed phase chromatography 등의 기술을 통해 6-12개의 fraction 으로 분리하게 됩니다. 분리된 peptide fractions 들을 따로 분석하게 됩니다. Protein level은 복합체 시료를 SDS-PAGE 등으로 분자량에 따라 1차 분리를 진행하고, SDS-PAGE gel 을 여러 slice로 잘라 in-gel digestion 과정을 통해서 peptide 를 생성하게 됩니다. 각 slice 들에서 생성된 peptide 들을 따로 LC-MS/MS 분석을 진행합니다.

정량 단백체학은 cell, protein, peptide level 에서 stable isotope 을 labeling 하는 방식을 활용합니다. 연구자 분들은 단백체학 실험실과 논의하여 각 연구 목적에 맞게 방법을 선택하여 분석을 진행하여야 합니다. TMT (Tandem mass tags) : TMT isobaric chemical tag 을 사용하여 peptide 에 labeling 함으로서 6 – 10 개의 시료를 동시에 정성, 정량 분석할 수 있는 방법입니다. Peptide 와 Protein 에 있는 lysine 잔기의 free amino termini 에 TMT tag 이 labeling 됩니다. Isobaric tag 의 특성상 MS1 분석에서는 동일한 mass 값을 가지기 때문에 구별이 안되지만, MS/MS 분석을 통해서 각 isobaric tag 은 unique 한 mass 값을 가지는 report ion 을 생성하게 되고, 이 report ion 의 intensity를 측정하여 6-10개의 시료를 동시에 정량 할 수 있게 됩니다.

Labeled 방식과 다르게 stable isotope labeling 을 진행하지 않고, 일반적인 복합체 시료 분석과 같은 방식으로 전처리 및 LC-MS/MS 분석을 진행합니다. 재현성 높은 liquid chromatography 를 사용하여, 각 시료를 반복 분석하여서 peptide 의 intensity 등을 측정하여 정량 분석을 진행합니다.

다중반응 모니터링 (multiple reaction monitoring, MRM)은 질량분석기 내에 3개의 mass analyzer (Quadrupole, Q)가 있어서 Q1에서 특정 mass를 갖는 precursor ion를 분리한 후, Q2 collision cell에서 fragment로 만들고 Q3에서 특정 mass를 갖는 fragment ion을 분리해서 분석하는 방식을 말합니다. MRM 방식을 통해 동시에 수백개까지 peptide 분석이 가능하며, 탁월한 선택성, 감도 및 재현성으로 단백질의 상대정량 및 절대정량이 가능합니다.

데이터 비의존성 분석 (Data independent analysis, DIA)은 Q1에서 precursor ion을 분리하고 collision cell에서 fragment로 만든 후 orbitrap에서 특정 isolation width안에 들어오는 fragment ion을 검출하는 방식을 말합니다. 사전에 구축된 spectral library통해서 펩타이드를 검출하고 정량분석이 이루어지게 됩니다. 동시에 분석할 수 있는 peptide수가 MRM 방식보다 많으며 spectral library 확장을 통해서 기존 데이터에서 새로운 target 단백질의 정량분석이 가능합니다.